細胞轉(zhuǎn)染效率低下的幾個大坑:1.不注意細節(jié)在轉(zhuǎn)染之前更換一次37℃預溫的培養(yǎng)基,可提高轉(zhuǎn)染效率。脂質(zhì)體和DNA/RNA混合物應當一滴一滴地滴下來,從培養(yǎng)皿一邊滴到另一邊,邊滴邊輕搖培養(yǎng)皿,以確保均勻分布和避免局部高濃度。這些都是一些細枝末節(jié),但是,如果不注意的話,也會造成轉(zhuǎn)染效率低下。2.細胞狀態(tài)不好細胞狀態(tài)不好,會導致轉(zhuǎn)染效率低下。一般進行轉(zhuǎn)染的細胞應該處于對數(shù)生長期。如果是貼壁細胞的話,貼壁率應該在70-80%;如果是懸浮細胞的話,應該是6X105個/孔(24孔板),一般是轉(zhuǎn)染前現(xiàn)在換液,轉(zhuǎn)染前用無血清培養(yǎng)基或PBS洗細胞一次。轉(zhuǎn)染的整個過程都不應該有物品。細胞鋪板密度用于轉(zhuǎn)染的較佳細胞密...
細胞轉(zhuǎn)染實驗簡介實驗步驟:1、細胞傳代(1)試驗準備:200ul/1mlTip頭各一盒(以上物品均需高壓滅菌),酒精棉球,廢液缸,試管架,微量移液器,記號筆,培養(yǎng)皿,離心管。(2)棄掉培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基,用1ml的PBS溶液洗滌兩次。(3)用Tip頭加入1mlTrypsin液,消化1分鐘(37。C,5%CO2)。用手輕拍培養(yǎng)瓶壁,觀察到細胞完全從壁上脫落下來為止。(4)加入1ml的含血清培養(yǎng)基終止反應。(5)用頭多次吹吸,使細胞完全分散開。(6)將培養(yǎng)液裝入離心管中,1000rpm離心5min。(7)用培養(yǎng)液重懸細胞,細胞計數(shù)后選擇0.8X106個細胞加入一個35mm培養(yǎng)皿。(8)將合適體積完全...
如何提高細胞轉(zhuǎn)染效率:1.組織培養(yǎng)試劑優(yōu)化細胞生長條件。只使用新鮮配制的培養(yǎng)基和添加劑,并經(jīng)可能減少所用試劑的變更?;A培養(yǎng)基—目前所使用的各種市售培養(yǎng)基(如,RPMI1640和DMEM)。培養(yǎng)基的成分包括營養(yǎng)物質(zhì)(氨基酸,葡萄糖),維生素,無機鹽,和緩沖物質(zhì)。有些成分非常不穩(wěn)定,因此如果不在使用時新鮮加入就可能會產(chǎn)生問題。務必要使培養(yǎng)基避光保存。因為已知有一些組分和緩沖物質(zhì),如HEPES,當暴露于光照下就會分解產(chǎn)生細胞毒性物質(zhì)。另外,血清,添加劑,來自于培養(yǎng)箱內(nèi)的污染物、化學物質(zhì),或/細胞的污染也都可能影響到細胞生理。2.細胞生長狀態(tài)密切觀察您的細胞;確保它們狀態(tài)良好。在開始轉(zhuǎn)染細胞之前,先...
瞬時轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染效率的監(jiān)測:基因的瞬時表達在24-72小時內(nèi)就結(jié)束了。這種快速的瞬時表達非常適用于驗證質(zhì)粒表達和監(jiān)測轉(zhuǎn)染步驟的效率??梢允褂脠蟾婊騺泶_定優(yōu)化條件,其表達蛋白易檢測,在目的細胞中不含此蛋白或水平很低。常用的報告基因包括氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT),綠色熒光蛋白(GFP),熒光素酶(Lux或Luc)以及b-半乳糖苷酶(b-gal)。可以使用簡單的非同位素方法檢測b-gal的表達以測定轉(zhuǎn)染效率和活性。pCMVSPORT-bgal質(zhì)粒包含CMV啟動子調(diào)控下的LacZ基因,轉(zhuǎn)染入真核細胞內(nèi)后可以直接表達bgal。結(jié)合簡單的檢測步驟,可以做為監(jiān)測轉(zhuǎn)染條件的一種方便靈敏的方法瞬時和穩(wěn)定表達DN...
如何高效率實現(xiàn)細胞轉(zhuǎn)染:DNA轉(zhuǎn)染導入細胞胞漿內(nèi)的DNA不能穿過細胞核的核膜("核屏障")。在細胞有絲分裂過程中核膜溶解,DNA進入細胞核才有可能。為此,細胞處于分裂期對DNA轉(zhuǎn)染是至關重要的,并且處于分裂期的細胞比例必須盡可能大才能實現(xiàn)高效轉(zhuǎn)染。DNA轉(zhuǎn)染機制示意圖如下所示:轉(zhuǎn)染RNA(siRNA/miRNA/mRNA)對于RNA轉(zhuǎn)染是沒有"核屏障"的,因為RNA不需要進入細胞核發(fā)揮其生物學效應,因此細胞分裂對它沒有影響。轉(zhuǎn)染試劑的選擇理想的轉(zhuǎn)染試劑選擇可以使您的實驗如虎添翼!真核細胞的先天免疫系統(tǒng),使它們能夠檢測外來物質(zhì)如脂多糖、細菌或細菌核酸和蛋白質(zhì),并克制潛在病原體的入侵。此外,細胞通...
細胞轉(zhuǎn)染效率低下的幾個大坑:1.試劑過期有時候轉(zhuǎn)染效率低下,還要考慮會不會存在試劑過期的情況。毛博當年做轉(zhuǎn)染整整半年,百思不得其解。較后發(fā)現(xiàn),原來是Lipofectamine2000過期了。換了之后,立馬成功。根據(jù)我的經(jīng)驗,盡量使用開封半年內(nèi)的,因為過了半年后,就算沒有過失效期,但是細胞毒性較大增加,而轉(zhuǎn)染效率卻較大下降。千萬不要為了省錢,影響實驗進度哈。2.未加血清轉(zhuǎn)染后未及時加入血清,會導致細胞大量死亡。一般要在轉(zhuǎn)染后的4-6小時換液且換為有血清的培養(yǎng)基。根據(jù)毛博的經(jīng)驗,其實也可以在原來的無血清培養(yǎng)基里面滴加血清。這個時候,較好不要換液,不要打擾細胞,讓它安安靜靜地休息。但是也不能過早加入...
細胞轉(zhuǎn)染效率低下的幾個大坑:1.試劑過期有時候轉(zhuǎn)染效率低下,還要考慮會不會存在試劑過期的情況。毛博當年做轉(zhuǎn)染整整半年,百思不得其解。較后發(fā)現(xiàn),原來是Lipofectamine2000過期了。換了之后,立馬成功。根據(jù)我的經(jīng)驗,盡量使用開封半年內(nèi)的,因為過了半年后,就算沒有過失效期,但是細胞毒性較大增加,而轉(zhuǎn)染效率卻較大下降。千萬不要為了省錢,影響實驗進度哈。2.未加血清轉(zhuǎn)染后未及時加入血清,會導致細胞大量死亡。一般要在轉(zhuǎn)染后的4-6小時換液且換為有血清的培養(yǎng)基。根據(jù)毛博的經(jīng)驗,其實也可以在原來的無血清培養(yǎng)基里面滴加血清。這個時候,較好不要換液,不要打擾細胞,讓它安安靜靜地休息。但是也不能過早加入...
如何提高細胞轉(zhuǎn)染效率:1.組織培養(yǎng)試劑優(yōu)化細胞生長條件。只使用新鮮配制的培養(yǎng)基和添加劑,并經(jīng)可能減少所用試劑的變更。基礎培養(yǎng)基—目前所使用的各種市售培養(yǎng)基(如,RPMI1640和DMEM)。培養(yǎng)基的成分包括營養(yǎng)物質(zhì)(氨基酸,葡萄糖),維生素,無機鹽,和緩沖物質(zhì)。有些成分非常不穩(wěn)定,因此如果不在使用時新鮮加入就可能會產(chǎn)生問題。務必要使培養(yǎng)基避光保存。因為已知有一些組分和緩沖物質(zhì),如HEPES,當暴露于光照下就會分解產(chǎn)生細胞毒性物質(zhì)。另外,血清,添加劑,來自于培養(yǎng)箱內(nèi)的污染物、化學物質(zhì),或/細胞的污染也都可能影響到細胞生理。2.細胞生長狀態(tài)密切觀察您的細胞;確保它們狀態(tài)良好。在開始轉(zhuǎn)染細胞之前,先...