免疫組化實驗流程介紹：

英瀚斯生物為您整理總結免疫組化詳細步驟：

1、SP三步法

1）石蠟切片，常規脫蠟至水。

2）0.3%或3%H2O2去離子水（無色液體）孵育10-30分鐘，以滅活內源性過氧化物酶活性。

3）蒸餾水沖洗，PBS浸泡5分鐘

4）候選步驟：采用抗原修復：微波（建議30分鐘內4次中火）、高壓、酶修復方法。自然冷卻，再用3分鐘×3次.

5）血清封閉：室溫15-30分鐘，盡可能與二抗來源一致。傾去，勿洗。

6）滴加適當比例稀釋的一抗，37℃孵育2~3小時或4℃過夜（比較好復溫）。PBS沖洗，3分鐘×5次。

7）滴加生物素標記的二抗，室溫或37℃孵育30分鐘-1h。

8）PBS沖洗，3分鐘×5次。

9）滴加SP（鏈霉親和素-過氧化物酶），室溫或37℃孵育30分鐘-1h。

10）PBS沖洗，3分鐘×5次。

11）顯色劑顯色（DAB等）。

12）自來水充分沖洗。

13）可進行復染，脫水，透明。

14）選擇適當的封片劑封片。 動物、細胞的免疫組化、免疫熒光，就找英瀚斯生物！陜西病理免疫組化是什么

實驗失敗常見問題分析有哪些：

為什么在顯微鏡下觀察發現所有的切片都成陰性？

答：這種現象主要是由操作不當導致，可能的原因有：1.染色操作不當，致使染色失敗；2.漏加一種抗體或者制備出的抗體沒有活性；3.緩沖液中有疊氮化鈉，抑制了酶的活性；4.復染或脫水劑使用不當等。建議逐一排查，找到原因后重新進行實驗。

在顯微鏡下觀察發現所有的切片都成陽性，這是為什么？答：與上一個問題類似，出現的原因也是試驗操作存在問題，可能的原因有：1.切片在染色過程中抗體過濃，或者干片了；使用的呈色底物溶液已變色或呈色反應時間過長；3.抗體溫育的時間過長等。

在顯微鏡下觀察發現切片的背景很深，這是為什么？答：以下幾方面會導致切片的背景過深：1.蛋白質封閉不夠或所用血清溶血，造成抗體的非特異性反應；2.內源性過氧化酶沒有完全阻斷，顯色過程中過氧化酶與酶底物反應，造成背景；3.底物呈色反應時間過長或呈色反應后漂洗不徹底。 陜西病理免疫組化是什么免疫組化IHC詳細介紹！

什么是免疫組化？免疫組化的原理是什么？

1、定義：用標記的特異性抗體對組織切片或細胞標本中某些化學成分的分布和含量進行組織和細胞原位定性、定位或定量研究，這種技術稱為免疫組織化學（immunohistochemistry）技術或免疫細胞化學（immunocytochemistry）技術。

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2、原理：根據抗原抗體反應和化學顯色原理，組織切片或細胞標本中的抗原先和一抗結合，再利用一抗與標記生物素、熒光素等的二抗進行反應，前者再用標記辣根過氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（如鏈霉親和素等）結合，通過呈色反應或熒光來顯示細胞或組織中化學成分，在光學顯微鏡或熒光顯微鏡下可清晰看見細胞內發生的抗原抗體反應產物，從而能夠在細胞爬片或組織切片上原位確定某些化學成分的分布和含量。

免疫組化實驗注意事項總結：

?本實驗室所用切片一般是石蠟切片。

?烘片：使蠟片水分蒸發，石蠟軟化，組織切片牢固貼在玻片上；烘片至跟烘片前透明度有差異。

?抗原修復時，使片子始終浸沒在修復液中，液體不能干。

?一抗孵育在37度培養箱，濕盒放置1h，省時間和結合效果好，不要超過1h，容易過染。

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?二抗使用：兩個二抗放大信號或一個二抗；若抗體信號強，可不用放大信號，盡量增大信噪比。

?10XDAB在常溫溶解，盡可能現用現配，放于4度儲存時間久了效果不佳。

?復水和脫水時所用的梯度酒精不可混用，要區分開。

?加抗體和顯色液時，都要將片子甩干，在半干半濕的狀態下再加，不然容易造成溶液的二次稀釋。

?整個操作過程中在顯色之前，一定不能干片。 免疫組化相關知識匯總。

免疫組化如何才能充分脫蠟？

 （1）蠟不溶于水，如果脫蠟不干凈，少許蠟存留于切片上，將會引起染色不均勻、陽性物時隱時現、真假難辨、背景染色增加等。為了解決上述的問題，切片在染色前必須徹底脫蠟，目前用于脫蠟的試劑主要是二甲苯，因它脫蠟力強，脫蠟時間較短； 

（2）脫蠟的時間要根據季節，室溫和試劑的新鮮謀面是在不同。如果在夏天，室溫較高，脫蠟試劑也新鮮，則脫蠟時間不需很多，3-5分鐘就已足夠。如果在冬天，室溫較低，脫蠟試劑也較陳舊，則脫蠟時間需要延長，10-20分鐘或更長。

（3）當天切的切片，燒烤2小時后進行染色，切片帶有溫度進行脫蠟這將可加速脫蠟的過程，如果預先切好烤好的切片，在染色前，還必須對切片進行加溫10-20分鐘，然后再行脫蠟，這樣脫蠟速度加快，效果魁偉更好。總之，操作時應根據不同的季節，不同的室溫，不同的試劑來決定，脫蠟的時間，原則上是要徹底、干凈、完全地脫去切片上的蠟。

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英瀚斯生物做免疫組化怎么樣？陜西病理免疫組化是什么

做免疫組化時如何選擇一抗？

1、單克隆和多克隆抗體的選擇。由一種克隆產生的特異性抗體叫做單克隆抗體。單克隆抗體能目標明確地與單一的特異抗原決定簇結合，就像導彈精確地命中目標一樣。另一方面，即使是同一個抗原決定簇，在機體內也可以由好幾種克隆來產生抗體，形成好幾種單克隆抗體混雜物，稱為多克隆抗體。在抗原抗體反應中，一般單克隆抗體特異性強，但親和力相對小，檢測抗原靈敏度相對就低；而多克隆抗體特異性稍弱，但抗體的親和力強，靈敏度高，但易出現非特異性染色（可以通過封閉等避免）。

2、應用范圍的選擇。有的一抗只能用于Westernblotting，或免疫組化、免疫熒光、免疫沉淀等；甚至標明石蠟切片或冰凍切片。

3、種屬反應性的選擇（speciesreactivity）。這一點很重要，表明這種抗體可能存在種屬差別，且這種抗體適合檢測哪種種屬動物體內的抗原。

4、種屬來源，一般兔來源的多是多克隆抗體；而小鼠來源的多是單克隆抗體，但也有另外。根據此來源來選擇相應的二抗。

5、生產廠家的選擇。

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