免疫組化實驗流程介紹：

英瀚斯生物為您整理總結免疫組化詳細步驟：

1、SP三步法

1）石蠟切片，常規脫蠟至水。

2）0.3%或3%H2O2去離子水（無色液體）孵育10-30分鐘，以滅活內源性過氧化物酶活性。

3）蒸餾水沖洗，PBS浸泡5分鐘

4）候選步驟：采用抗原修復：微波（建議30分鐘內4次中火）、高壓、酶修復方法。自然冷卻，再用3分鐘×3次.

5）血清封閉：室溫15-30分鐘，盡可能與二抗來源一致。傾去，勿洗。

6）滴加適當比例稀釋的一抗，37℃孵育2~3小時或4℃過夜（比較好復溫）。PBS沖洗，3分鐘×5次。

7）滴加生物素標記的二抗，室溫或37℃孵育30分鐘-1h。

8）PBS沖洗，3分鐘×5次。

9）滴加SP（鏈霉親和素-過氧化物酶），室溫或37℃孵育30分鐘-1h。

10）PBS沖洗，3分鐘×5次。

11）顯色劑顯色（DAB等）。

12）自來水充分沖洗。

13）可進行復染，脫水，透明。

14）選擇適當的封片劑封片。 英瀚斯生物免疫組化，高效高質量出結果。貴州動物組織免疫組化推薦

病理醫師日常工作中經常說的一句話應該就是“做個免疫組化吧”；不管是臨床醫師，還是患者，他們問的多的問題則是“為什么要做免疫組化？”病理醫師通過“特殊染色”來進行細胞的識別。這一做法的依據是特定細胞和組織中的成分不同、則化學性質不同，通過染色的方法則可以呈現不同顏色。不過，由于組織固定或儲存等，會造成相應物質的活性降低甚至消失，因而限制了特殊染色方法的應用。隨著免疫學研究的進展，根據抗原與相應抗體間特異性結合的性質，則有了現在免疫組化的方法：不同細胞、不同組織中抗原有一定差異，抗體與被測組織中的特定抗原結合，進而通過一定顯色方法將結合的抗體顯示出來。如有相應顯色，則證實可能有被測抗原；無顯色則可能無被測抗原。當然，這一方法中需注意相應的“例外”，如抗體的非特異性結合、非特異性顯色，則容易造成“假陽性”；或者雖有相關抗原、但所用抗體與該抗原并未結合等，則容易造成“假陰性”。隨著免疫組化的應用經驗的增加，這些問題在常規應用中盡量得以避免，前者如各種顯色方法的優化；后者如抗原修復方法的優化、新型抗體開發及選擇。細胞免疫組化外包常見的免疫組化方法有哪些？

確定cancer分期，免疫組化技術應用于臨床可以進行處理哦，英瀚斯生物為您處理。cancer分期是判斷預后的一個指標，與是否浸潤、有無淋巴管或血管侵襲密切相關，而通過免疫組化方法可以判斷cancer是否浸潤、有無淋巴管或血管侵襲。層黏連蛋白和Ⅳ型膠原的單克隆抗體可以清楚的顯示基膜的主要成分，用于區分原位*和浸潤*，一旦上皮性*突破基膜為浸潤，未突破基膜為原位;顯示血管和淋巴管內皮細胞的標記物第八因子相關蛋白、D2-40等則可清楚顯示cancer對血管或淋巴管的浸潤。因此對許多cancer的良惡性鑒別及有無血管或淋巴管浸潤，免疫組化結果作為主要的鑒別依據。

實驗失敗常見問題分析有哪些：

為什么在顯微鏡下觀察發現所有的切片都成陰性？

答：這種現象主要是由操作不當導致，可能的原因有：1.染色操作不當，致使染色失?。?.漏加一種抗體或者制備出的抗體沒有活性；3.緩沖液中有疊氮化鈉，抑制了酶的活性；4.復染或脫水劑使用不當等。建議逐一排查，找到原因后重新進行實驗。

在顯微鏡下觀察發現所有的切片都成陽性，這是為什么？答：與上一個問題類似，出現的原因也是試驗操作存在問題，可能的原因有：1.切片在染色過程中抗體過濃，或者干片了；使用的呈色底物溶液已變色或呈色反應時間過長；3.抗體溫育的時間過長等。

在顯微鏡下觀察發現切片的背景很深，這是為什么？答：以下幾方面會導致切片的背景過深：1.蛋白質封閉不夠或所用血清溶血，造成抗體的非特異性反應；2.內源性過氧化酶沒有完全阻斷，顯色過程中過氧化酶與酶底物反應，造成背景；3.底物呈色反應時間過長或呈色反應后漂洗不徹底。 大鼠、小鼠組織免疫組化，找英瀚斯生物。

免疫組化的局限性，可能會有假陽性。陽性信號定位不正確即為假陽性，包括著色不勻、背景著色、邊緣效應，另外組織的某些特定成分也能導致假陽性結果。假陽性可能的原因有:(1)一抗濃度及一抗是否失效，抗體有一個合適的濃度范圍且必須在有效期內使用，過期的抗體或者不著色，或者背景著色，形成假陽性;(2)試劑未充分覆蓋組織，組織邊緣的試劑易干濃度較組織中間高致深染;(3)抗體孵育時間過長，由于室溫的影響夏季孵育時間稍短，冬季孵育時間稍長;(4)操作過程中組織變干，造成組織邊緣收縮或損壞形成偽影，產生假陽性;(5)3，3'-二氨基聯苯胺(DAB)顯色時間太長，DAB宜現配現用，配制時間比較好在30min以內;(6)由于胞漿里含有較多的蛋白質，因此間質和胞漿中出現很多非特異性的染色，如內源性酶血紅蛋白、肌紅蛋白等造成的著色，可以通過血清封閉解決;乳腺cancer組織中的脂肪細胞、淋巴細胞也會產生非特異性的染色;(7)非特異性抗體吸附常見于壞死組織中，使壞死組織呈較高的背景染色，在免疫組化中應避免選擇壞死組織較多的蠟塊。如何做好免疫組化實驗？貴州小鼠免疫組化推薦

免疫組化檢測經驗總結！貴州動物組織免疫組化推薦

免疫組化實驗所用的組織和細胞標本是什么樣的？

實驗所用主要為組織標本和細胞標本兩大類，前者包括石蠟切片（病理大片和組織芯片）和冰凍切片，后者包括組織印片、細胞爬片和細胞涂片。其中石蠟切片是制作組織標本**常用、**基本的方法，對于組織形態保存好，且能作連續切片，有利于各種染色對照觀察；還能長期存檔，供回顧性研究；石蠟切片制作過程對組織內抗原暴露有一定的影響，但可進行抗原修復，是免疫組化中優先的組織標本制作方法。

英瀚斯生物具有專業病理團隊，染色分析一站搞定！ 貴州動物組織免疫組化推薦