引物的設計對于這個實驗至關重要，因為Real-time PCR的檢測靈敏度比較高，所以相應的對引物設計的要求就很高。普通的要求規則大家都知道，還有幾點必須注意：1，引物的錯配率（引物錯配形成引物二聚體，但是SYBR照樣能嵌入進去，結果導致實驗結果的誤差很大，重復性也不好）。2，引物的特異性一定要高（不像常規PCR，引物同源性不高，只要兩條產物的片段長度相差足夠大，在電泳的時候能夠區分開就可以。Real-time PCR只有在熔解曲線的時候能分開，所以這就造成整個實驗結果誤差很大，不可信）。在PCR產物中，由于內標與靶模板的長度不同。深圳血液定量PCR方案

Real-time PCR：基線（baseline)：通常是3－15個循環的熒光信號，同一次反應中針對不同的基因需單獨設置基線。閾值（threshold)：自動設置是3-15個循環的熒光信號的標準偏差的10倍。手動設置：置于指數擴增期，剛好可以清楚地看到熒光信號明顯增強。同一次反應中針對不同的基因可單獨設置閾值，但對于同一個基因擴增一定要用同一個閾值。Ct值：與起始濃度的對數成線性關系，分析定量時候一般取Ct:15-35.太大或者太小都會導致定量的不準確。相對定量：通過與內參基因Ct值之間的相差來計算基因之間的表達差異,一般是2-△△Ct。或者是考慮擴增效率的Pfaffl法。深圳血液定量PCR方案Real-time PCR包括病原微生物或病毒含量的檢測。

Real-time PCR鏈式反應的特點：靈敏度高：PCR產物的生成量是以指數方式增加的，能將皮克(pg=10-12）量級的起始待測模板擴增到微克（μg=-6）水平。能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞；在病毒的檢測中，PCR的靈敏度可達3個RFU(空斑形成單位）；在細菌學中很小檢出率為3個細菌。簡便、快速：PCR反應用耐高溫的TaqDNA聚合酶，一次性地將反應液加好后，即在DNA擴增液和水浴鍋上進行變性-退火-延伸反應，一般在2～4小時完成擴增反應。擴增產物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。純度要求低：不需要分離病毒或細菌及培養細胞，DNA粗制品及RNA均可作為擴增模板。可直接用臨床標本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發、細胞、活組織等DNA擴增檢測。武漢微量Real-time PCR供應商聚合酶鏈反應的試劑應分配到一次性的等分試樣中。

Real-time PCR的染料法和探針法的選擇：進行mRNA表達量的測定，采用染料法是比較經濟實惠的；染料法可以通過比較熔解曲線的熔解峰位置得到產物特異性的情況；目的基因和內參基因分管檢測，染料法可以選用Realtime染料PCRPreMIX，探針法主要應用于病毒RNA的檢測；以及單位點突變（SNP）；多基因的合并檢測，探針法還可用于同一個反應中同時檢測目的基因和內參基因的情況；而染料法則必須分管檢測。Real-time PCR：實時熒光定量PCR技術（Real-timequantitativePolymeraseChainReaction簡稱Real-time PCR）是在定性PCR技術基礎上發展起來的核酸定量技術。實時熒光定量在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，使每一個循環變得“可見”，之后通過Ct值和標準曲線對樣品中的DNA(orcDNA)的起始濃度進行定量的方法。聚合酶鏈反應的這種能力增強了許多方法，例如生成雜交探針用于雜交。

Real-time PCR-傳統定量PCR：1）內參照法：在不同的PCR反應管中加入已定量的內標和引物，內標用基因工程方法合成。上游引物用熒光標記，下游引物不標記。在模板擴增的同時，內標也被擴增。在PCR產物中，由于內標與靶模板的長度不同，二者的擴增產物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強度，以內標為對照定量待檢測模板。2）競爭法：選擇由突變克隆產生的含有一個新內切位點的外源競爭性模板。在同一反應管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增（其中一個引物為熒光標記）。Real-time PCR可看作是生物體外的特殊DNA復制。深圳血液定量PCR方案

Real-time PCR提高實驗的重復性。深圳血液定量PCR方案

聚合酶鏈式反應：因為PCR擴增了目的DNA區域，所以PCR可以用于分析極少量的樣品。這對于法醫檢定法，當時只有微量的DNA可作為證據。聚合酶鏈反應也可用于分析古代DNA那已經有數萬年的歷史了。這些基于聚合酶鏈反應的技術已經成功地應用于動物身上，例如四萬年前猛犸，以及人類DNA，定量聚合酶鏈反應或者實時聚合酶鏈反應不要與逆轉錄-聚合酶鏈反應方法混淆)允許估計樣品中存在的給定序列的量——這種技術通常用于定量確定基因表達的水平。定量PCR是一種已建立的DNA定量工具，用于測量每輪PCR擴增后DNA產物的積累。聚合酶鏈反應的試劑應分配到一次性的等分試樣中。深圳血液定量PCR方案

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