冷凍電鏡技術具有分辨率高、更接近天然狀態、適用研究對象普遍等特點，越來越多的科學家開始把冷凍電鏡技術作為研究的一個新方向。冷凍電鏡技術與X射線技術和核磁共振技術互相補充，讓絕大多數的蛋白質的結構都可以被解析。眾多領域的研究者們將在未來冷凍電鏡新的技術方法的開發中發揮重要的作用，成為該技術的進一步完善與成熟的重要力量。冷凍電鏡領域研究者們則需要以主動開放的態度吸引其他領域研究者的合作，并積極迎接來自更多領域研究者的挑戰，保持并發展自己的技術特長，站在技術發展的制高點上選準研究方向，始終在冷凍電鏡的技術前沿上開疆拓土。冷凍電鏡技術中單顆粒分析法優點：解析生物大分子的理論分辨率可達原子級。東莞生物冷凍透射電子顯微鏡技術原理

冷凍電鏡技術是什么呢？冷凍電鏡用于生物樣品三維結構解析，包含單顆粒分析、微晶電子衍射和冷凍電子斷層掃描3種技術。冷凍電鏡單顆粒分析技術（cryo-EMSPA）是一種以單顆粒形式分析生物分子組裝的新方法，通過將負染電鏡篩選獲得的合適濃度的生物分子樣品快速冷凍，使生物大分子以近天然狀態存在于無定形冰中，然后進行冷凍樣品的篩選、數據收集和三維結構解析，從而獲得高分辨率的生物分子結構。冷凍電鏡單顆粒分析技術能夠從分子層面進行詳細的研究，解析基于結構的藥物研發的分子基礎，而冷凍電子斷層掃描能夠從亞細胞水平觀察目標分子在原位細胞環境中的作用位點和作用機制，相信在不久的將來能夠用于進一步確認基于結構的藥物研究的可靠性。微晶電子衍射不只能夠進行小分子微晶結構解析，也可與現有技術互補，進行生物大分子及其復合物的微晶結構解析。東莞生物冷凍透射電子顯微鏡技術原理冷凍電鏡技術的獨特優勢：冷凍電鏡單粒子法既可以對具有對稱結構的大分子進行研究。

冷凍電鏡技術近年來獲得了迅猛的發展，取得了許多具有重大意義的成果。冷凍電鏡將生物分子進行冷凍便可進行高分辨率成像，還具有分辨率高、更接近天然狀態、適用研究對象普遍等優勢。同時，系統地綜述了冷凍電鏡技術在科學研究中的應用，并展望冷凍電鏡技術未來的發展。冷凍電鏡（cryo-electronmicroscopy，cryo-EM）技術，是在低溫下使用透射電子顯微鏡觀察樣品的顯微技術，即把樣品冷凍并保持低溫放進顯微鏡里面，用高度相干的電子作為光源從上面照射，透過樣品和附近的冰層，受到散射，再利用探測器和透鏡系統把散射信號成像記錄下來，較后進行信號處理，得到樣品的結構。

冷凍電子顯微鏡技術中單顆粒重構技術：該技術也叫做單顆粒分析，主要適用于結構具有全同性的生物大分子的結構解析，蛋白質的分子量通常要求在100KD以上，在顆粒數目足夠多的情況下，理論上其分辨率可以達到原子水平。該方法的圖像處理和三維重構計算過程如下:從原始的電鏡照片中將顆粒圖像挑選出來，對其進行二維圖像對中、分類和平均，然后通過計算等價線的方法推算各分類圖的取向，利用傅里葉重構法建立始三維結構模型，通過對原始圖片或分類平均圖與結構模型投影的匹配，優化取向參數，進而得到更準確的三維結構模型，如此反復對初始結構模型進行修正，直到收斂獲得較終的結果。單顆粒重構技術近年來發展迅速，應用普遍，不斷有文章報道利用此技術所獲得的大分子復合物的三維結構。冷凍電鏡技術之冷凍透射電鏡通過對樣品的冷凍，降低電子束對樣品的損傷，從而得到更加真實的樣品形貌。

冷凍電鏡技術解析結構的一般流程是怎樣的？對樣品的要求是什么？冷凍電鏡解析蛋白結構一般流程為：蛋白表達純化；負染樣品準備：約2小時完成；負染樣品的數據收集：約8小時完成；冷凍樣品的準備：約4小時完成；冷凍樣品的數據收集：48-120小時完成。三維結構重建。冷凍電鏡解析蛋白結構對蛋白質的要求：分子量：一般需要樣品的分子量在200kD以上。緩沖液：緩沖液中不能含有多糖，DMSO，甘油等有機物質，這些會降低樣品的襯度，難以獲得高分辨的三維結構。一般而言，緩沖液為20mMHepes，150mMNaCl。濃度：一般而言，可溶性蛋白濃度應在1mg/ml左右，膜蛋白應保證濃度在5mg/ml左右。體積：20ul足夠（前提是需要蛋白濃度達標，做一個樣品3ul左右）。均一性：分子篩行為表現為單一的峰，均一性大于90%。將冷凍樣品保持低溫放置在透射電子顯微鏡下觀察，從而獲得生物大分子的結構，被稱為冷凍電鏡技術。東莞生物冷凍透射電子顯微鏡技術原理

冷凍電鏡技術將生物分子進行冷凍便可進行高分辨率成像，還具有分辨率高等優勢。東莞生物冷凍透射電子顯微鏡技術原理

冷凍電鏡技術未來之路在何方?除了蛋白等生物大分子外，生物樣品還有很重要的一面是細胞和組織。即使是目前有很多重要的蛋白結構都得到了埃米級別的解析，但由于它們都是純化出來的，已經脫離了原來位置，就如同一片樹葉脫離了大樹，研究的再深刻，目前也只是一葉遮目，不要說推測這片樹葉在森林里的位置，即使是在哪顆特定大樹上的生長部位和結構都很難說。因此解析細胞或組織這樣大尺度的高分辨精細結構具有更普遍的生物學意義。東莞生物冷凍透射電子顯微鏡技術原理

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