聚合酶鏈式反應：Taq(水生棲熱菌)聚合酶耐熱DNA聚合酶的很好活性溫度約為75-80°C(167-176°F),盡管該酶通常使用72°C(162°F)的溫度。在該步驟中，DNA聚合酶通過從反應混合物中添加在5’-至-3’方向上與模板互補的游離DNA鏈來合成與DNA模板鏈互補的新DNA鏈，在新生(伸長)DNA鏈的末端，將dNTPs的5'-磷酸基與3'-羥基縮合。延伸所需的精確時間取決于所使用的DNA聚合酶和要擴增的DNA目標區域的長度。根據經驗，在很好溫度下，大多數DNA聚合酶每分鐘聚合一千個堿基。在很好條件下(即，如果沒有限制底物或試劑的限制)，在每個延伸/延伸步驟中，DNA靶序列的數量加倍。隨著每一個連續的循環，原始模板鏈加上所有新產生的鏈成為下一輪延伸的模板鏈，導致特定DNA目標區域的指數(幾何)擴增。為了很大限度地減少污染的可能性，調查人員應該為試劑制備、聚合酶鏈反應和產品分析預留單獨的房間。徐州細胞定量PCR原理及步驟

聚合酶鏈反應允許快速生產短DN段，即使已知的引物序列不超過兩個。聚合酶鏈反應的這種能力增強了許多方法，例如生成雜交 探針用于 Southern 或northern blot 雜交。聚合酶鏈反應為這些技術提供了大量的純DNA，有時是單鏈的，甚至可以從非常少量的起始材料中進行分析。脫氧核糖核酸測序的任務也可以通過聚合酶鏈反應來輔助完成。已知的DN段可以很容易地從患有遺傳疾病突變的患者體內產生。對擴增技術的修飾可以從完全未知的基因組中提取片段，或者可以產生感興趣區域的單鏈。聚合酶鏈反應有許多應用于傳統的 DNA克隆。它可以從更大的基因組中提取片段以插入載體，這可能只有少量可用。使用一組“載體引物”，它還可以分析或提取已經插入載體的片段。聚合酶鏈反應方案的一些改變可以產生突變(通用的或定點的)插入片段。徐州細胞定量PCR原理及步驟聚合酶鏈反應應經常使用帶有一次性柱塞和超長移液器吸頭的移液器。

聚合酶鏈反應的常見問題分析與解決方法：擴增產物出現多條帶(雜帶)：引物用量偏大，引物的特異性不高。應調換引物或降低引物的使用量。循環的次數過多。適當增加模板的量，減少循環次數。酶的用量偏高或酶的質量不好，應降低酶量或調換另一來源的酶。退火溫度偏低，退火及延伸時間偏長。應提高退火溫度，減少變性與延伸時間，也可采用二種溫度的PCR擴增。以2度為梯度設計梯度PCR反應優化退火溫度。 樣品處理不當。Mg2+濃度偏高，因適當調整Mg2+使用濃度。若為PCR試劑盒，也可能時試劑盒本身質量有問題。復制提前終止。使用非熱啟動的聚合酶時常有發生。冰上準備反應體系或采用熱啟動聚合酶。

聚合酶鏈式反應：模板的制備，PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。模板的取材主要依據PCR的擴增對象，可以是病原體標本如病毒、細菌、菌類等。也可以是病理生理標本如細胞、血液、羊水細胞等。法醫學標本有血斑、精斑、毛發等。標本處理的基本要求是除去雜質，并部分純化標本中的核酸。多數樣品需要經過SDS和蛋白酶K處理。難以破碎的細菌，可用溶菌酶加EDTA處理。所得到的粗制DNA，經酚、氯仿抽提純化，再用乙醇沉淀后用作PCR反應模板。電子PCR被提出作為分子生物學的教育工具。

聚合酶鏈式反應的常見問題：陰性：需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠。引物：引物質量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為：選定一個好的引物合成單位。引物的濃度不但要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現，而且兩引物帶的亮度應大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應和引物合成單位協商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。引物應高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導致引物變質降解失效。引物設計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。PCR產物的生成量是以指數方式增加的，能將皮克量級的起始待測模板擴增到微克水平。徐州細胞定量PCR原理及步驟

聚合酶鏈式反應：DNA的半保留復制是生物進化和傳代的重要途徑。徐州細胞定量PCR原理及步驟

聚合酶鏈式反應的常見問題：Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴增的特 異性，濃度過低則影響PCR擴增產量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。反應體積的改變：通常進行PCR擴增采用的體積為20ul、30ul、50ul。或100ul，應用多 大體積進行PCR擴增，是根據科研和臨床檢測不同目的而設定，在做小體積如20ul 后，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。物理原因：變性對PCR擴增來說相當重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出現假陰性；退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影響引物與模板的結合而降低PCR擴增效率。有時還有必要用標準的溫度計，檢測一下擴增儀或水溶鍋內的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。徐州細胞定量PCR原理及步驟

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