細(xì)胞凍存時間和操作步驟：1、首先我們需要凍存培養(yǎng)液，通常細(xì)胞凍存液含10%的DMSO，或者是甘油、10-20%的小牛血清；、取對數(shù)生長期細(xì)胞，并且還需要用PBS進(jìn)行清洗，需要注意在這里要丟棄掉舊的細(xì)胞凍存液；3.去除PBS，加入適量的胰蛋白酶，以覆蓋住培養(yǎng)皿表面為宜，然后把單層生長的細(xì)胞消化掉；然后離心1000rpm5min時間；4、去除胰蛋白酶，加入凍存培養(yǎng)液，輕輕吹打使細(xì)胞的分布變得均勻，調(diào)節(jié)細(xì)胞較終的密度為5×106/ml-1×107/ml，需要注意這是較佳的細(xì)胞密度；5、將細(xì)胞裝入凍存管之中，每管的含量應(yīng)該保持在1～1.5ml之間。在凍存管上標(biāo)明細(xì)名稱、時間、操作者；6、較后要說的就是細(xì)胞凍存的時間了，對于標(biāo)準(zhǔn)的凍存程序來說，需要進(jìn)行梯度降溫，降溫速率-1～-2℃/min，一旦溫度達(dá)到-25℃以下時，那么就可增至-5℃～-10℃/min；等到-100℃的時候，可迅速的放入到液氮之中。可以防止或減少冷凍冰晶對細(xì)胞的損傷作用。無錫貴陽無血清細(xì)胞凍存液

細(xì)胞凍存，我們應(yīng)該注意哪些事項(xiàng)：DMSO快速稀釋會對細(xì)胞造成滲透性損傷，使存活率下降50%。對于DMSO凍存的細(xì)胞，復(fù)蘇后應(yīng)緩慢稀釋成細(xì)胞懸液：1）凍存液：培養(yǎng)基=1:1稀釋成細(xì)胞懸液后離心，然后重懸至培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，隔天換液；2）凍存液：培養(yǎng)基=1:10稀釋成細(xì)胞懸液，不用離心，直接放置到培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)2-4小時后，換液。上述兩種方法都是比較常用的細(xì)胞復(fù)蘇方法，后者更適用于原代細(xì)胞或比較難養(yǎng)的細(xì)胞。液氮內(nèi)的細(xì)胞凍存較長時間不要超過半年，凍存在液氮中的細(xì)胞應(yīng)一段時間內(nèi)進(jìn)行更替。一個細(xì)胞系在培養(yǎng)一個月后，可復(fù)蘇一管新的細(xì)胞確保其質(zhì)量沒有發(fā)生太大變化，傳代幾次后，再凍存留種。無錫貴陽無血清細(xì)胞凍存液鏡檢后，研究者可根據(jù)各自方法和需要來進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。

細(xì)胞凍存液的作用是什么？滲透性冷凍保護(hù)劑：可以滲透到細(xì)胞內(nèi)，一般是一些小分子物質(zhì)，主要包括甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。非滲透性冷凍保護(hù)劑：不能滲透到細(xì)胞內(nèi)，一般是些大分子物質(zhì)，主要包括聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白以及Hetastarch等。冷凍保護(hù)劑同溶液中的水分子結(jié)合，發(fā)生水合作用，弱化水的結(jié)晶過程使溶液的粘性增加從而減少冰晶的形成，同時冷凍保護(hù)劑可以通過在細(xì)胞內(nèi)外維持一定的摩爾濃度，降低細(xì)胞內(nèi)外未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度，使細(xì)胞免受溶質(zhì)的損傷。滲透性冷凍保護(hù)劑的保護(hù)機(jī)制是在細(xì)胞冷凍懸液完全凝固之前，滲透到細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)外產(chǎn)生一定的摩爾濃度，降低細(xì)胞內(nèi)外未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度，從而保護(hù)細(xì)胞免受高濃度電解質(zhì)的損傷同時。細(xì)胞內(nèi)水分也不會過分外滲，避免了細(xì)胞過分脫水皺縮。

無血清細(xì)胞凍存液的操作規(guī)范：1、培養(yǎng)細(xì)胞至對數(shù)生長晚期，顯微鏡觀察其外觀、形態(tài)、有無污染等。選擇狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行凍存操作(注：貼壁生長細(xì)胞，用胰蛋白酶消化并用完全培養(yǎng)基終止消化，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù);懸浮生長細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù))。2、500～1000g離心5min，棄上清。3、加入適量的細(xì)胞凍存液，重懸細(xì)胞，使細(xì)胞濃度達(dá)到1～10×106/ml，置于凍存管中密閉。4、采取逐級降溫保存：4℃放置20min，-20℃放置30min，-70℃過夜，置于液氮罐中長期存儲。注意：務(wù)必超凈工作臺內(nèi)無菌操作，避免污染。雜交瘤細(xì)胞凍存時應(yīng)定期復(fù)蘇，以檢查細(xì)胞的活性和分泌抗體的穩(wěn)定性。無血清細(xì)胞凍存液用于其他類型哺乳動物細(xì)胞的儲存。

凍存細(xì)胞注意事項(xiàng)：冷凍保護(hù)劑可降低培養(yǎng)基的冰點(diǎn)，并可減緩冷卻速度，較大降低冰晶形成的危險(冰晶可損傷細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞死亡)。注：DMSO可促進(jìn)有機(jī)分子進(jìn)入組織。操作含DMSO的試劑時，應(yīng)采用與此類物質(zhì)安全危害相適應(yīng)的設(shè)備和操作規(guī)范，并應(yīng)按照當(dāng)?shù)胤ㄒ?guī)處置此類試劑。建議可使用廠商生產(chǎn)的無血清細(xì)胞凍存液，使用方便，復(fù)蘇率高。注意冷凍保護(hù)劑DMSO的品質(zhì)：DMSO應(yīng)為試劑級等級，無菌且無色，以5-10ml小體積分裝，4℃避光保存，勿作多次解凍待凍存管中細(xì)胞混合液完全融化后，立即加入1 ml細(xì)胞培養(yǎng)基于該冷凍管中與細(xì)胞混合。無錫貴陽無血清細(xì)胞凍存液

無血清細(xì)胞凍存液使用方法：取相當(dāng)于所需細(xì)胞數(shù)的細(xì)胞懸浮液量，置于離心管中。無錫貴陽無血清細(xì)胞凍存液

細(xì)胞凍存液的配制可選用10%的DMSO加上90%的小牛血清，可以現(xiàn)用現(xiàn)配。除了這個方式，還可選擇20%的DMSO機(jī)上80%的小牛血清，配成兩倍的儲存液，在使用時細(xì)胞懸液和凍存液按照1:1的比例混勻使用，特別的方便。凍存液可直接置于-20攝氏度的環(huán)境中保存。使用細(xì)胞凍存液需要注意以下幾點(diǎn)：1、在使用凍存液前，需要確保細(xì)胞凍存液已經(jīng)完全融化，并要輕輕的混勻。對融化后的細(xì)胞凍存液要置于4℃的環(huán)境中保存。2、使用凍存液之前應(yīng)該確保凍存前的細(xì)胞生長情況比較良好，比如說細(xì)胞需要處于對數(shù)生長期，并且凍存的時候存活率大于90%。3、在使用細(xì)胞凍存液期間，為了保證可以發(fā)揮較佳的效果，建議將細(xì)胞凍存在液氮之中，這樣可以長時間的進(jìn)行保存。如果說將細(xì)胞置于-80℃的環(huán)境下保存，那么保存的時間大約為1年。4、細(xì)胞凍存液如果需要做標(biāo)記的話，要使用耐受有機(jī)溶劑的馬克筆進(jìn)行標(biāo)記，以防被酒精或異丙醇等擦掉，不能辨識。無錫貴陽無血清細(xì)胞凍存液

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