Genovis的ImpaRATOR? 和 OpeRATOR? - 兩種協同的作用：O-糖蛋白酶。使用ImpaRATOR或OpeRATOR消化后分析依那西普重糖基化區域O-聚糖位點的覆蓋率（圖3）。使用OpeRATOR鑒定對應于所有13個O-聚糖位點的肽，而使用ImpaRATOR只能明確鑒定10個位點。ImpaRATOR 可能比 OpeRATOR （1） 具有更具選擇性的氨基酸序列偏好，此處由 S186 和 T245 位點缺乏消化來表明。此外，ImpaRATOR 在兩個相鄰的 O-糖基化氨基酸之間顯示出有限的裂解，如 S213 位點酶解肽的缺乏以及 T200 和 T217 位點酶解肽的低強度所證明的那樣。在OpeRATOR酶解樣品（T184-S199和T200-H204;圖2b和d），而在ImpaRATOR消化的樣品中，具有漏裂的相應肽（S184-H204）的強度更高。 雖然OpeRATOR顯示出更高的O-聚糖位點覆蓋率，但使用ImpaRATOR進行消化可以表征O-聚糖結構，包括唾液酸化物種。例如，條形圖插入顯示了兩種糖肽 T184-V198 和 T205-P207 的 O-聚糖種類。這應該與使用OpeRATOR的消化進行比較，在OpeRATOR中，必須去除唾液酸才能產生酶活性，這意味著有關唾液酸化的信息丟失。總而言之，ImpaRATOR 和 OpeRATOR 酶共同提供了有關聚糖組成和 O-聚糖位點的完整信息。上海倍篤生物涵蓋藥物研發的全流程，抗體結構域分析蛋白酶、蛋白聚糖分析水解酶等。海南PNGaseF去糖基化酶疾病機理研究

OglyZOR 來源于口腔鏈球菌，在大腸桿菌中表達。該酶含有 His 標簽，分子量為 227 kDa。SialEXO來源于Akkermansia muciniphila，在大腸桿菌中表達。SialEXO酶含有His標簽，組分的分子量分別為42 kDa和66 kDa。1.高效O-糖苷酶；2. 降低樣品異質性，揭示潛在的關鍵蛋白質修飾；3. 完全、穩健地去除 O-糖he心 1 二糖。Genovis的凍干酶，用于水解糖蛋白上的he心1 O-聚糖。OglyZOR 凍干劑以凍干粉的形式提供，裝在 2000 個單位的小瓶中，用于在 2 mg 糖蛋白上水解he心 1 O-聚糖。它需要去除唾液酸助劑才能發揮作用，因此與2000單位的SialEXO凍干一起提供。海南PNGaseF去糖基化酶疾病機理研究水解ɑ2-3-連接唾液酸的凍干酶SialEXO 2-3，裝在500個單位的小瓶中，用于0.5mg糖蛋白的去唾液酸化。

α連接的Genovis的GalNAcs的水解：GalNAcEXO 是一種 α-N-乙酰半乳糖胺苷酶，可有效水解糖蛋白上的末端 GalNAc 殘基。與絲氨酸或蘇氨酸連接的 GalNAc（稱為 Tn 抗原）被 GalNAcEXO 快速有效地水解，并且該酶還在 α1-3 連接的末端 GalNAcs 上顯示出活性。Genovis的GalNAcEXO 是一種外α-N-乙酰半乳糖胺酶，用于有效水解與糖蛋白（Tn 抗原）中的絲氨酸或蘇氨酸殘基相連的 α-N-乙酰半乳糖胺 （GalNAc）。該酶還在 α1-3 連接的末端 GalNAc 上顯示活性。GalNAcEXO 在天然條件下水解糖蛋白上的 GalNAc，在 pH 值 6.0 至 7.6 范圍內具有高度活性。

Genvois的SialEXO產品是唾液酸酶，用于N-和O-糖基化蛋白的有效去唾液酸化。SialEXO凍干由兩種唾液酸酶組成，每種唾液酸酶都具有獨特的活性，并且它們同時起作用。一種酶對α2-3、α2-6和α2-8連接的唾液酸具有很好的活性，另一種酶（SialEXO 2-3）通過α2-3-鍵快速水解唾液酸。SialEXO凍干可在2小時內去除天然蛋白質上的所有唾液酸。SialEXO在天然條件下水解糖蛋白，在pH值范圍為6.5至9時顯示出活性。這些酶來源于Akkermansia muciniphila，并在大腸桿菌中表達。兩種酶都含有 His 標簽，酶的分子量為 43 kDa 和 66 kDa。 OglyZOR 來源于口腔鏈球菌，在大腸桿菌中表達。該酶含有 His 標簽，分子量為 227 kDa。

蛋白質的N-糖基化特征是一個關鍵的質量屬性。它會影響生物制藥的安全性和有效性，因此需要在開發和生產過程中進行表征和監測。常見的聚糖分析工作流程是用PNGase F釋放N-聚糖，然后用熒光標記物（如2-AB、2-AA、普魯卡因胺或RapiFluor-MS?（沃特世公司））標記生成的聚糖。然后使用HILIC-HPLC或毛細管電泳分離標記的聚糖，以表征和定量不同的聚糖結構。 在這里，使用游離聚糖方法分析zhiliao性抗體曲妥珠單抗、Fc-融合蛋白依那西普和糖蛋白RNase B的N-聚糖。曲妥珠單抗和依那西普在天然條件下在37°C下用Genvois的PNGase F去糖基化1小時，而RNase B需要變性和還原才能完全去糖基化。因此，在50°C下用PNGase F去糖基化10分鐘之前，用RapiGest? SF表面活性劑（沃特世公司）和TCEP處理RNase B。 用RapiFluor-MS標記所得游離的聚糖，并通過HILIC UPLC-FLD-MS進行分析。OglyZOR 酶可有效水解天然糖蛋白中的he心 1 二糖 （Gal-β1,3-GalNAc）；海南PNGaseF去糖基化酶疾病機理研究

在天然條件下用固定化PNGase F去除zhiliao性抗體；海南PNGaseF去糖基化酶疾病機理研究

為了研究 OglyZOR 對天然糖蛋白的活性，將該酶與依那西普、TNFR 和阿巴西普在 37°C 下有或沒有 SialEXO 孵育 1 小時。當唾液酸被去除時，OglyZOR酶有效地水解了所有三種底物中的O-聚糖。Genovis的OglyZOR 酶可有效水解天然糖蛋白中的he心 1 二糖 （Gal-β1,3-GalNAc）。這使得這些酶適合在LC-MS分析之前制備樣品，以鑒定其他PTM或確認氨基酸序列O-糖基化生物制藥的全去糖基化：O-糖基化生物制藥（如依那西普）很難表征。為了能夠通過質譜法測定完整質量數，我們進行了酶促總去糖基化。N-聚糖被Genovis的PNGase F裂解，而O-聚糖可以與OglyZOR和SialEXO一起去除。。海南PNGaseF去糖基化酶疾病機理研究